Ossidazione anaerobica del propano accoppiata alla riduzione dei nitrati da parte di un lignaggio all'interno della classe Symbiobacteriia

Nature Communications volume 13, numero articolo: 6115 (2022) Citare questo articolo

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Si ritiene che i microrganismi anaerobici svolgano un ruolo fondamentale nella regolazione del flusso di alcani gassosi a catena corta (SCGA; inclusi etano, propano e butano) dagli ecosistemi terrestri e acquatici all'atmosfera. È stato confermato che il solfato agisce come accettore di elettroni supportando l'ossidazione anaerobica microbica degli SCGA, tuttavia molti altri accettori energeticamente più favorevoli coesistono con questi gas in ambienti anaerobici. Qui, mostriamo che un bioreattore seminato con biomassa proveniente da un impianto di trattamento delle acque reflue può eseguire l'ossidazione anaerobica del propano accoppiata alla riduzione dei nitrati in gas diazoto e ammonio. Il bioreattore è stato utilizzato per più di 1000 giorni e abbiamo utilizzato esperimenti di marcatura 13C e 15N, analisi metagenomiche, metatrascrittomiche, metaproteomiche e dei metaboliti per caratterizzare la comunità microbica e i processi metabolici. I dati suggeriscono collettivamente che una specie che rappresenta un nuovo ordine all’interno della classe batterica Symbiobacteriia è responsabile dell’ossidazione del propano dipendente dai nitrati osservata. Il genoma chiuso di questo organismo, che chiamiamo "Candidatus Alkanivorans nitratireducens", codifica i percorsi per l'ossidazione del propano in CO2 tramite aggiunta di fumarato e per la riduzione dei nitrati, con tutti i geni chiave espressi durante l'ossidazione del propano dipendente dai nitrati. I nostri risultati suggeriscono che il nitrato è un importante dissipatore di elettroni per l’ossidazione degli SCGA in ambienti anaerobici, costituendo un nuovo collegamento mediato dai microbi tra i cicli del carbonio e dell’azoto.

Una notevole quantità di gas naturale viene generata dai sedimenti delle profondità marine e dalle infiltrazioni di idrocarburi nei margini continentali e negli ecosistemi terrestri1,2. La maggior parte del gas naturale rilasciato viene consumato dai microrganismi nelle zone anossiche prima che il gas si diffonda negli ambienti ossici e nell'atmosfera3,4,5. Gli studi sull’ossidazione anaerobica del gas naturale si sono concentrati sul potente gas serra, il metano, come componente più abbondante (~60–90%)6,7. Tuttavia, anche gli alcani gassosi a catena corta (SCGA), tra cui etano, propano, n-butano e iso-butano, sono costituenti sostanziali del gas naturale (fino al 20% circa)8 e sono importanti precursori dell'ozono e degli aerosol organici9. Si stima che le emissioni atmosferiche globali degli SCGA siano pari a 9,2–9,6 Tg yr−1 per l'etano, 9,6–10,5 Tg yr−1 per il propano, 10 Tg yr−1 per il butano e 4,2 Tg yr−1 per l'isobutano10.

L'ossidazione anaerobica del metano (AOM) è stata ampiamente studiata ed è relativamente ben compresa7,11,12,13,14,15,16,17. Gli archaea metanotrofi anaerobici (ANME) ossidano il metano attraverso la via della metanogenesi inversa, incluso il complesso chiave metil-CoM reduttasi (MCR). L'ANME trasporta gli elettroni dal metano ai batteri sintrofici solfato-riduttori (SRB)11,12 o direttamente alla riduzione dei nitrati e degli ossidi metallici13,14,15,16. Il batterio "Candidatus Methylomirabilis oxyfera" esegue l'AOM attraverso la via di ossidazione del metano "intra-aerobica" utilizzando il nitrito come unico accettore di elettroni17. È probabile che i microrganismi associano anche l'ossidazione degli SCGA alla riduzione di questi accettori di elettroni in condizioni anossiche18. 'Circa. M. oxyfera' si è dimostrato in grado di ossidare l'etano e il propano tramite la metano monoossigenasi, sebbene sia ancora da dimostrare se queste fonti di carbonio supportino la crescita19. Ad oggi, il solfato è stato l’unico dissipatore di elettroni identificato per supportare l’ossidazione anaerobica degli SCGA20,21,22,23,24,25. L'isolato deltaproteobatterico Desulfosarcina aeriophaga BuS5 ossida propano e butano attraverso la via di addizione del fumarato generando succinati alchil-sostituiti, un processo mediato dall'alchilsuccinato sintasi (ASS)20,21, e riduce direttamente il solfato a solfuro. È stato scoperto che un arricchimento dell'archeone 'Candidatus Syntrophoarchaeum' attiva il butano attraverso la formazione del butil-coenzima M, un processo catalizzato da un MCR divergente, con equivalenti riducenti incanalati verso partner SRB sintrofici23. Allo stesso modo, l'ossidazione anaerobica dell'etano è stata collegata al relativo "Candidatus Argoarchaeum ethanivorans", che codificava anche un complesso simile a MCR ed è stato suggerito che formasse una relazione sintrofica con SRB22. Tuttavia, deve ancora essere identificato un archeone in grado di mediare l’ossidazione anaerobica del propano direttamente accoppiata alla riduzione dei solfati.

90% and >70% bootstrap values, respectively. The scale bars indicate amino acid substitutions per site. b A composite fluorescence micrograph of the enrichment culture hybridized with the SYMB-1018 FISH probe (Cy3, red; targeting ‘Ca. A. nitratireducens’) and stained with DAPI (blue; all microbial cells). ‘Ca. A. nitratireducens’ cells appear magenta (blue + red). The scale bar indicates 20 μm. The representative image was selected based on the visual assessment of six separate hybridisation experiments. Consistent results were also obtained independently with two additional probes targeting the ‘Ca. A. nitratireducens’ population (Supplementary Fig. 8). c, d Relative expression of each genome and unbinned contigs, and microbial metabolism of interest for the genomes in the bioreactor. The total transcripts per million (TPM) was calculated for each gene. Genome sets with overall expression of total TPM > 1% are shown (c). KEGG annotation was used to identify ORFs coding for denitrification (M00529) and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (M00530) pathways (d). Source data are provided as a Source Data file./p> 147.2) of the enriched culture extracts (n = 3, taken at various time points) revealed a peak at retention time 10.832 min, matching the peak of the iso-propylsuccinate standard. b A peak at retention time 11.078 min (ion transition, m/z: 289 > 147.1), corresponding to the peak from the propylsuccinate standard, was observed for cell extracts from the enriched culture (n = 3 at different sampling points). c Phylogenetic relationship of ‘Ca. A. nitratireducens’ AssA (Red) to other AssA and BssA in the NCBI database. Three AssA subunits (AssA123) found in ‘Ca. A. nitratireducens’ MAG formed a separate cluster. Bootstrap values >90% are shown as black dots on branch nodes. Scale bar represents amino acid substitutions per site./p> 147.2) and propylsuccinate (m/z: 289 > 147.1) standards were detected in the cell extracts (Fig. 4a, b). These findings support the hypothesis that ‘Ca. A. nitratireducens’ activates propane through homolytic C-H bond cleavage at both primary and secondary carbon atoms, and with addition of fumarate, yields propylsuccinate and iso-propylsuccinate. In addition, iso-propylsuccinate (5.96 nM) was more abundant than propylsuccinate (2.33 nM) in the culture extracts, suggesting the secondary carbon atom activation generating iso-propylsuccinate is the main route of propane oxidation (Fig. 5)./p> Q5. Among them, 12 million reads were longer than 1000 bp with read N50 of 6,135 bp. Adapters were trimmed using Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop)./p> 30 was selected and mapped to the KEGG Orthology database. The eggNOG v5 database was searched against using emapper 2.1.5 in diamond mode. Conserved motif(s) present within the predicted genes related to propane oxidation and nitrogen metabolism were further verified using NCBI's conserved domain search62. Annotated KO numbers were used for inferring the pathway encoded in each genome. Pathways were identified as ‘not expressed’ if missed blocks > 75% when total blocks > 5, or missed blocks > 1 when total blocks ≤ 5./p>92% similarity), the probes were designed against the 16 S sequence of ‘Ca. A. nitratireducens’ and care should be taken in their application beyond well characterised systems. Given there are no cultured representatives available for probe validation, three FISH probes were designed to target different sites on the ‘Ca. A. nitratireducens’ 16 S rRNA to give higher confidence in their specificity. These included the SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) and SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ) probes. Unlabelled helper probes78 were designed to target the flanking regions of each probe site to increase accessibility to the target site for optimal fluorescent signal (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Helper probes were applied in equimolar amounts with their respective probe. The 5ʹ and 3ʹ ends of the oligonucleotide FISH probes were labelled with the Cy3 fluorophore and were synthesized by Integrated DNA Technologies, Singapore. A higher signal was achieved for these FISH probes with lysozyme pre-treatment of the biomass (0.5 mg ml−1 in 0.05 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH 8) for 30 min at room temperature. The Non-EUB nonsense probe was used as a negative hybridization control79. DAPI (1 ng/µl) staining of cells was performed for 15 min in the dark. The labelled biomass was visualized with a Stellaris5 white light laser confocal microscope (Leica, Germany)./p>

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