La modulazione reciproca della produzione di ammoniaca e melanina ha implicazioni sulla virulenza criptococcica

Nature Communications volume 14, numero articolo: 849 (2023) Citare questo articolo

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Il fungo Cryptococcus neoformans è l’agente eziologico della criptococcosi, una malattia che è uniformemente letale se non trattata con farmaci antifungini, ma i regimi attuali sono ostacolati dalla tossicità dell’ospite e dalla resistenza ai patogeni. Un approccio alternativo interessante per combattere questa malattia mortale è il targeting diretto dei meccanismi di virulenza derivati ​​​​dagli agenti patogeni. C. neoformans esprime molteplici fattori di virulenza che sono stati studiati precedentemente come entità isolate. Tra questi ci sono l’ureasi, che aumenta il pH fagosomiale e promuove l’invasione cerebrale, e la melanizzazione, che protegge dalle cellule immunitarie e dai trattamenti antifungini. Qui riportiamo una reciproca interdipendenza tra questi due fattori di virulenza. Le cellule che idrolizzano l'urea rilasciano gas di ammoniaca che agisce a distanza per aumentare il pH e aumentare i tassi di melanizzazione per le cellule vicine, che a sua volta riduce la secrezione di vescicole extracellulari che trasportano ureasi. Questa relazione reciproca si manifesta come una proprietà emergente che potrebbe spiegare perché è stato difficile prendere di mira i meccanismi di virulenza isolati per lo sviluppo di farmaci e suggerisce un approccio più olistico che consideri la virulenza composita.

I fattori di virulenza sono tratti che conferiscono ai microbi infettivi la capacità di danneggiare e persistere negli ospiti infetti nonostante le risposte immunitarie1. Sebbene i patogeni tendano a impiegare molteplici fattori di virulenza, inclusi rivestimenti superficiali, tossine ed enzimi, la maggior parte degli studi si concentra sul contributo indipendente alla patogenicità di un singolo fattore senza considerare il suo contributo al composito di virulenza2. I meccanismi attraverso i quali interagiscono i fattori di virulenza sono un argomento relativamente inesplorato nella patogenesi microbica.

C. neoformans esprime una serie diversificata di fattori di virulenza che includono una capsula polisaccaridica, la produzione di melanina e l'espressione di vari enzimi come ureasi e fosfolipasi, tra gli altri. La capsula polisaccaridica e il pigmento melaninico proteggono rispettivamente dalla fagocitosi e dai burst ossidativi delle cellule fagocitiche3,4. L'ureasi è un enzima nutrizionale che interferisce incidentalmente con l'acidificazione dei fagosomi idrolizzando l'urea per generare ammoniaca5 e svolge un ruolo cruciale nell'invasione cerebrale6,7, mentre la fosfolipasi danneggia le membrane fagosomiali dei macrofagi e promuove la sopravvivenza intracellulare8. Ci sono poche informazioni su come questi fattori di virulenza interagiscono tra loro.

Questo studio caratterizza l'interazione tra l'attività dell'ureasi criptococcica e la melanizzazione. L'ureasi viene rilasciata nelle vescicole extracellulari e idrolizza l'urea per produrre ammoniaca, che qui viene mostrata mediare l'azione a distanza attraverso la sua capacità di viaggiare come gas. La reazione di melanizzazione dipende dal pH ed è quindi promossa dall'aumentata produzione di ammoniaca da parte dell'ureasi. È stato scoperto che una maggiore melanizzazione favorisce la persistenza delle cellule criptococciche all'interno dei fagosomi e quindi aumenta la diffusione cerebrale attraverso un meccanismo del cavallo di Troia. La deposizione di melanina nella parete cellulare agisce come un meccanismo di feedback riducendo la produzione di vescicole extracellulari per inibire il rilascio di ureasi associata alle vescicole. Pertanto, l'ureasi e la melanina mostrano una modulazione reciproca che fornisce vantaggi nei diversi stadi dell'infezione e questa coordinazione e sinergia dei fattori di virulenza si traduce in cambiamenti fenotipici che non avrebbero potuto essere previsti studiando ciascun componente isolatamente.

Analizzando l'attività dell'ureasi di C. neoformans nel brodo rapido di urea9, abbiamo notato che con un tempo di incubazione prolungato, anche i terreni nei pozzetti privi di cellule aumentavano il pH (Fig. 1a, pannello di sinistra). La misurazione dell'assorbanza a 560 nm (A560) per ciascun pozzetto ha rivelato una relazione lineare diretta tra il cambiamento di colore nel pozzetto privo di cellule e il numero di cellule nel pozzetto adiacente (Fig. 1a, pannello di destra). Per determinare se questo fenomeno dipendesse dall'attività dell'ureasi, le cellule wild-type (WT) o carenti di ureasi (ure1∆) sono state coltivate in brodo urea in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti insieme a terreni privi di cellule nei restanti pozzetti. 23 pozzi. Dopo l'incubazione a 30 ˚C per 24 ore, i terreni nel pozzetto contenente cellule WT e diversi pozzetti circostanti hanno cambiato colore da giallo a rosa mentre non è stato osservato alcun cambiamento di colore per la piastra contenente cellule ure1∆ (Fig. 1b, pannello di sinistra). La relazione sigmoidale tra A560 dei mezzi privi di cellule e la distanza dalle cellule WT che producono ammoniaca (Fig. 1b, pannello di destra) assomigliava a una curva di titolazione del pH per la quale il punto medio è il pKa. Un adattamento dei dati alla curva di Boltzmann fornisce un valore medio di 56 mm e suggerisce che il pH dei terreni in otto pozzetti entro questa distanza è aumentato ad almeno 7,9, il pKa del rosso fenolo nel brodo di urea. Utilizzando un rilevatore di gas di ammoniaca portatile con un intervallo di 0–200 ppm, l'ammoniaca è stata rilevabile durante letture di 30 s per colture coltivate in brodo di urea per 24 ore a 30 ˚C con una densità cellulare iniziale minima di 2 × 106 cellule/mL quando la concentrazione di urea è stata mantenuta costante al 2% (Fig. 1c, pannello di sinistra) o con una concentrazione minima di urea dello 0,25% e una densità cellulare costante di 1 × 108 cellule/mL (Fig. 1c, pannello di destra). In entrambi i casi, la quantità cumulativa di ammoniaca prodotta durante le 24 ore era notevolmente più elevata, come evidenziato dall'aumento del pH dei terreni di coltura a densità cellulari e concentrazioni di urea ancora più basse (Fig. 1c).